北京凱吉特醫(yī)藥

 

附表：

 

 

一、適用范圍

2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑用于對咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、呼吸道洗液、抽吸液或其他呼吸道分泌物等樣本中的2019新型冠狀病毒核酸進行體外定性檢測。本審評要點適用于進行首次注冊申報的產品。

二、性能評估：

企業(yè)應提交在符合質量管理體系的生產環(huán)境下生產的試劑盒進行的所有性能驗證的研究資料，包括具體研究方法、實驗方案、實驗數(shù)據、統(tǒng)計分析等詳細資料。建議著重對以下分析性能進行研究。

1.核酸（RNA）提取/純化性能

在進行靶核酸檢測前，應有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應有相應的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。無論檢測試劑是否含有RNA分離/純化的組分，企業(yè)都應結合檢測試劑的特性，對配合使用的核酸提取試劑/方法的提取效率、提取核酸純度等做充分的驗證，提供詳細的驗證資料。

2.最低檢測限

（1）最低檢測限的確定

將含有2019新型冠狀病毒的真實臨床樣本/含有該病毒RNA片段的假病毒顆粒梯度稀釋于（與適用樣本一致的）適當基質中，用于進行最低檢測限研究，應采用科學的方法標定病毒滴度。每個濃度梯度最少重復三次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢測限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣品，每個濃度至少重復20次檢測，將具有90%～95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測限。

在進行最低檢測限的確定時，應至少包括不同來源的三個具有代表性的2019新型冠狀病毒樣本，進行系列梯度稀釋。

（2）最低檢測限的驗證

選擇不同來源的至少3個病毒樣本（與最低檢測限確定不同的病毒樣本）在最低檢測限濃度水平進行驗證，應達到90%～95%陽性檢出率。

應提供詳細的病毒液滴度的確定方法及驗證結果。

3.不同區(qū)域病毒樣本包容性的驗證

至少驗證包括具有時間和區(qū)域特征性的10個不同來源的病毒樣本（陽性臨床樣本或分離培養(yǎng)物），應包括最低檢出限、重復性等性能的驗證，病毒樣本的滴度應采用科學合理的方法進行標定。

4.分析特異性

（1）交叉反應驗證包括：

①地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒；

H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C組，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸道病毒A、B、C、D組，人間質肺病毒、人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨細胞病毒、輪狀病毒、諾如病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒；

肺炎支原體、肺炎衣原體；

軍團菌、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、結核分枝桿菌；  

煙曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌等。

建議在病毒和細菌感染的醫(yī)學相關水平進行交叉反應的驗證。通常，細菌感染的濃度水平為10⁶ cfu/ml或更高，病毒為10⁵ pfu/ml或更高，提供所有用于交叉反應驗證的病毒和細菌的來源、種屬/型別和濃度確認等試驗資料。

②人類基因組DNA。

（2）內源/外源物質干擾

應根據所采集樣本類型，針對可能存在的干擾情況進行驗證。建議申請人在每種干擾物質的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進行評價，在病毒臨界陽性水平進行干擾試驗驗證。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質（如血液、鼻腔分泌物、粘液及用于緩解淤血、鼻噪、刺激或哮喘和過敏癥狀的鼻腔和咽喉藥物、抗菌藥物、抗病毒藥物等）及在樣本采集和制備期間引入的物質。

表1 推薦用于干擾試驗的物質

物質	活性成分
粘蛋白	純化粘蛋白
血液（人類）
鼻腔噴霧劑或滴鼻劑	苯福林、羥甲唑啉、氯化鈉（含防腐劑）
鼻用皮膚類固醇	倍氯美松、地塞米松、氟尼縮松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松
過敏性癥狀緩解藥物	鹽酸組胺
抗病毒藥物	α-干擾素、扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、帕拉米韋、洛匹那韋、利托那韋、阿比多爾
抗生素	左氧氟沙星、阿奇霉素、頭孢曲松、美羅培南
全身性抗菌藥	妥布霉素

5.精密度

企業(yè)應對精密度指標，如標準差或變異系數(shù)等的評價標準做出合理要求。模擬樣本并不能體現(xiàn)臨床樣本可能帶來的所有變異因素，因此精密度評價中應同時包含若干臨床樣本，且精密度評價試驗應包含核酸分離/純化步驟。針對本類產品的精密度評價主要包括以下要求。

（1）對可能影響檢測精密度的主要變量進行驗證，除檢測試劑（包括核酸分離/純化組分）本身的影響外，還應對分析儀、操作者、地點、檢測輪次等要素進行相關的驗證。

（2）設定合理的精密度評價周期，例如：為期至少20天的檢測或者為期至少5天的檢測，具體方案可參考EP文件進行。從而對批內/批間、日內/日間以及不同操作者之間的精密度進行綜合評價。

（3）用于精密度評價的人工模擬樣品和臨床樣本均應至少包含3個水平：陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強）陽性樣品，并根據產品特性設定適當?shù)木芏纫螅R床樣本精密度評價中的每一次檢測均應從核酸提取開始。

①陰性樣本：待測物濃度低于最低檢測限或為零濃度，陰性檢出率應為100%（n≥20）。

②臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的最低檢測限，陽性檢出率應≥95%（n≥20）。

③中/強陽性樣本：待測物濃度呈中度到強陽性，陽性檢出率為100%且CV≤10%（n≥20）。

6.提供企業(yè)參考品驗證資料：根據主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設置情況，采用三批產品對企業(yè)參考品進行檢驗并提供詳細的實驗數(shù)據。

7.其他需注意問題

對于適用多個機型的產品，應提供產品說明書【適用機型】項中所列的所有型號儀器的性能評估資料。不同樣本類型應分別進行性能評估驗證.

三、注冊檢驗

應提供符合產品技術要求的、在具有相應醫(yī)療器械檢驗資質和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗機構進行的產品檢驗報告，應提供連續(xù)3個生產批次樣品的檢驗合格報告。

該項目已有國家參考品，應使用國家參考品進行注冊檢驗。

四、陽性判斷值確定資料

陽性判斷值確定資料主要指對申報產品病毒核酸檢測的Ct值，即結果判斷的臨界值進行確認的資料。陽性判斷值研究資料樣本來源應考慮不同年齡、性別、地域等因素，盡可能考慮樣本來源的多樣性、代表性。如存在判定值灰區(qū)，應提供灰區(qū)的確認資料。應說明所選擇陽性判斷值研究方法的合理性，閾值設置應科學合理。提供內標值的確定方法和研究資料。

五、主要原材料研究資料

此產品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質控品、參考品等。應提供主要原材料的選擇與來源、制備過程、質量標準等相關研究資料、質控品的定值試驗資料等。如主要原材料為企業(yè)自制，應提供其詳細制備過程；如主要原材料源于外購，應提供資料包括：選擇該原材料的依據及對比篩選試驗資料、供貨方提供的質量標準、出廠檢定報告，以及該原材料到貨后的質量檢驗資料。

1.引物和探針：應詳述引物和探針的設計原則，提供引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點及兩者的對應情況。建議每種病毒設計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和試驗等方式，對病毒進行包容性和特異性（如交叉反應）的評價，選擇最佳組合，并提交篩選的研究數(shù)據。引物、探針的質量標準應至少包括序列準確性、純度、濃度及功能性實驗等。

2.脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP、dTTP，應提供對其純度、濃度、功能性等的詳細驗證資料。

3.酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應分別對酶活性、功能性等進行評價和驗證。

4.試劑盒內質控品

試劑盒的質控體系通過設置各種試劑盒質控品來實現(xiàn)，其應參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程。以對整個提取和PCR擴增過程、試劑/設備、交叉污染等環(huán)節(jié)進行合理質量控制。申報資料應對試劑盒質控品有關原料選擇、制備、定值過程、濃度范圍等試驗資料詳細說明。企業(yè)應對質控品的檢測結果（如Ct值）做出明確的范圍要求。

4.1陰性質控品應不含試劑盒所檢測的靶序列。

4.2陽性質控品

陽性質控品可用1～2個病毒株為代表，應含有天然的或人工合成的包含試劑盒可檢測靶序列（如假病毒）。

 5.內對照（內標）可以對管內抑制導致的假陰性結果進行質量控制，應與靶核酸一同提取及擴增，申請人應對內對照（內標）的引物、探針設計和模板濃度做精確驗證，既要保證內標熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。對內對照的檢測結果（如Ct值）亦應做出明確的范圍要求。建議科學設置內對照（內標），對待側樣本的取樣質量、試劑的反應體系進行監(jiān)控。

6.企業(yè)參考品

應根據產品性能驗證的實際需要自行設定企業(yè)內部參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品、重復性參考品。

陽性參考品應著重考慮不同來源的病毒樣本和滴度要求，應至少選取不同來源的5個病毒樣本。

陰性參考品則主要涉及對交叉反應的驗證情況，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠狀病毒（可采用假病毒）、MERS冠狀病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。

檢測限參考品的濃度水平可采用90～95%陽性檢出水平或略高于最低檢測限的水平，如100%陽性檢出水平。檢測限參考品的濃度確定應科學合理。

重復性參考品建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應為最低檢出限附近的濃度。

申請人應對內部參考品的來源、型別鑒定、病毒滴度等信息進行精確的試驗驗證，并提交詳細的驗證資料。

六、主要生產工藝及反應體系的研究資料

1.介紹產品主要生產工藝，可用圖表方式表示，并說明主要生產工藝的確定依據。

2.反應原理介紹。

3.詳述樣本采集、樣本處理方式的選擇和設置，提供相關的研究資料。

（1）研究樣本采集時間點的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。

（2）研究對采樣拭子及樣本保存液的要求：對采樣拭子的材質要求（包括對拭子頭和拭子桿的要求），保存容器要求，裂解液、保存液成分、濃度、使用量的要求等。

4.確定最佳反應體系的研究資料，包括樣本用量、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取純度的情況下盡量擴大總反應體系和加樣量。

5.不同適用機型的反應條件如果有差異應分別詳述，并提交驗證資料。

6.如申報產品包含核酸分離/純化試劑，應提交對核酸分離/純化過程進行工藝優(yōu)化的研究資料。

七、穩(wěn)定性研究資料

穩(wěn)定性研究資料主要涉及兩部分內容，申報試劑的穩(wěn)定性和適用樣本的穩(wěn)定性研究。

1.申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，申請人可根據實際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。穩(wěn)定性研究資料應包括研究方法的確定依據、具體的實施方案、詳細的研究數(shù)據以及結論。對于實時穩(wěn)定性研究，應提供至少三批樣品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的研究資料。

2. 適用樣本的穩(wěn)定性

考慮到病毒RNA極易被降解的特性，企業(yè)也應對樣本穩(wěn)定性進行研究，包括采集后未經處理的樣本，加入裂解液/保存液的樣本，常規(guī)病毒滅活的樣本，保存條件包括冷藏和冷凍兩種條件。如產品適用拭子、痰液和灌洗液等不同的樣本類型，因其中干擾物質存在較大差異，可能對病毒RNA降解的影響不同，建議對每種樣本類型均進行研究。適于冷凍保存的樣本還應對凍融次數(shù)進行評價。

對于此類試劑，如核酸提取液不能立即進行檢測，則還需對核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進行研究。

八、臨床證據

新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑臨床試驗應按要求在三家以上臨床試驗機構進行（含各級疾病預防控制中心），通過考核試劑對來自臨床病例樣本的檢測結果與已上市同類產品檢測結果以及病例的臨床確診/排除結果進行對比，以驗證產品臨床性能。已上市同類產品檢測結果可獲取自病例臨床診療過程。如臨床試驗機構條件允許，推薦多家生產企業(yè)的試劑盒在相同的臨床試驗機構共同驗證。

1.臨床試驗對比方法

臨床試驗應選擇已上市的同類產品作為對比產品，同時，考慮考核試劑檢測結果與臨床確診/排除結果進行對比。國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診斷方案》及《全國各省（區(qū)、市）首例新型冠狀病毒感染的肺炎病例確認程序》等文件，病例確認方法應依據上述文件中規(guī)定的各省份首例病例確認程序及各省第二例及以后的感染病例的確認程序制定。不建議采用某一試驗地點的單次試驗結果作為確認結果。既往病例的確認結果可提交該病例的既往確認數(shù)據。

2.臨床試驗入組人群

臨床試驗的入組人群應為產品的預期適用人群，該產品的適用人群為新型冠狀病毒感染肺炎的疑似病例，國家衛(wèi)生健康委在不同時間階段發(fā)布了不同版本的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》，申請人在進行臨床試驗時應考慮當時現(xiàn)行方案對“疑似病例”的定義，按照該定義入組病例進行臨床研究，臨床試驗過程中應包括確診及排除病例。臨床試驗中應入組部分前期新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測陰性的確診病例，該部分病例可采用回顧性研究，臨床驗證的樣本包括：前期核酸檢測剩余樣本及病例確認所用樣本。同時，臨床試驗還可入組部分解除隔離和符合出院標準的病例，該部分病例陰性的確認應滿足現(xiàn)行的《新型冠狀病毒感染的肺炎診斷方案》中關于解除隔離和出院標準的要求。

3.臨床試驗樣本類型

試劑盒樣本采集建議按照《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南》進行。臨床試驗過程中，如臨床試驗過程中樣本確實難以獲得，經提取后的核酸提取液亦可作為樣本進行臨床試驗。如采用核酸提取液進行臨床試驗，建議臨床試驗中明確該核酸提取液對應的樣本類型及樣本保存液/采樣液（如適用），同時明確核酸提取試劑盒，臨床前應對臨床試驗中所涉及的樣本類型、樣本保存液及核酸提取試劑進行充分的性能評估，臨床試驗中所用樣本保存液及核酸提取試劑應嚴格滿足考核試劑及對比試劑要求。

臨床試驗中如病例可獲得多個樣本類型，如上、下呼吸道標本等，驗證過程中建議至少包括上呼吸道樣本和下呼吸道樣本。臨床試驗不同樣本類型及核酸提取液穩(wěn)定性應滿足考核試劑及對比試劑的要求。

4.臨床試驗樣本量

新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測試劑為定性產品，臨床試驗過程樣本量應能夠滿足評價臨床評價指標的要求，如臨床靈敏度、臨床特異度、陰陽性符合率等，建議入組確診病例不少于200例，排除病例不少于300例，同時入組部分解除隔離和符合出院標準的病例。入組病例中不同臨床嚴重程度、不同病程階段的患者均應有一定的例數(shù)。如申報試劑包含不同樣本類型，建議每種樣本類型單獨統(tǒng)計滿足統(tǒng)計學要求。

5.臨床試驗結果的統(tǒng)計分析

此類產品的臨床試驗目的在于驗證申報產品與臨床已應用的同類產品及臨床參考標準的一致性，統(tǒng)計分析一般以2×2表的形式對結果進行總結，并據此計算申報產品與對比產品的符合率、臨床靈敏度、臨床特異度及其置信區(qū)間。應將考核試劑與對比試劑檢測結果一致性及考核試劑檢測結果與臨床確認/排除結果的一致性分別進行統(tǒng)計分析，以評價產品臨床性能。

臨床試驗建議對入組人群的人口學進行分析，包括年齡、性別、臨床診斷背景、臨床分型等。臨床試驗中應對不同的人群進行分層統(tǒng)計，如確診/排除病例、前期新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測陰性的確診病例、及解除隔離和符合出院標準病例等。針對前期新型冠狀病毒2019-nCoV核酸檢測陰性的確診病例前期陰性樣本、及解除隔離和符合出院標準病例樣本，應描述考核試劑針對新型冠狀病毒2019-nCoV核酸的檢出率。臨床試驗中包含不同樣本類型的，應在總樣本數(shù)（各樣本類型總和）進行統(tǒng)計分析的基礎上，每個樣本類型分別進行統(tǒng)計分析。

臨床試驗中所有不一致結果均應結合患者的流行病學背景、臨床癥狀、疾病轉歸等信息進行充分的分析。

6. 臨床證據的形式要求

申請人應按照《體外診斷試劑注冊管理辦法》、《關于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準證明文件格式的公告》等法規(guī)文件要求提交各機構倫理審查意見、臨床試驗方案和臨床試驗報告以及臨床試驗總結報告。

臨床試驗數(shù)據匯總表作為臨床試驗報告的附件提交。數(shù)據表中應包括檢測病例的編號、年齡、性別、樣本類型、臨床診斷背景信息、考核試劑檢測結果（含各基因的Ct值）、對比試劑的檢測結果（各基因的Ct值）、新冠病毒感染的確診或排除結果等，如臨床試驗中所用樣本為核酸提取液，應明確該樣本樣本保存液（如涉及）、核酸提取試劑等。臨床應用的數(shù)據集中每一病例編號應能夠溯源。具體內容詳見附表。